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目前外泌体生产工艺普遍产量低、回收率或纯度低、靶向特异性差，使得外泌体的大规模生产仍是阻碍其发展的主要瓶颈之一。外泌体生产包括上游细胞培养工艺，下游分离纯化工艺，以及目标产品属性定义及详细表征等几大构成部分。
本文将为大家介绍动物细胞来源外泌体生产中的细胞培养技术和工艺。
外泌体可来源于几乎所有细胞，目前可通过GMP生产获得治疗性外泌体的主要有五类细胞，包括人心脏祖细胞、骨髓间充质干细胞 (MSCs)、脂肪组织来源的干细胞、树突状细胞 (DCs) 和 HEK293 细胞等。外泌体是细胞的分泌产物，因此其生产取决于以不改变细胞表型的方式生产大量细胞的能力。外泌体上游生产中，需依据细胞的特性选择不同的细胞培养工艺。
外泌体生产的主要细胞培养模式
一、小规模静态培养
产生外泌体的细胞在T型细胞培养瓶、培养皿等平面容器中静态培养，适合贴壁生长的细胞。上述五种常用于外泌体生产的细胞中除经过悬浮驯化的HEK293细胞外，都可采用静态培养，优点是工艺简单、易于建立，适合实验室水平早期研究开发。
二、放大培养
对于贴壁依赖细胞，扩大细胞培养规模主要通过扩大表面积。通过T-Flask、滚瓶、细胞工厂等进行的2D贴壁培养，培养规模相对有限，较难进行工艺放大。使用中空纤维生物反应器；或在Spinner或搅拌罐生物反应器（SR）中进行贴壁依赖细胞的微载体悬浮培养，可以克服单层贴壁细胞生产外泌体中表面积有限这一最大难题，通过在短时间内产生大量细胞和外泌体来提高效率。
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中空纤维生物反应器
优势和特点：
中空纤维生物反应器由半透毛细纤维和圆柱构成，外泌体生产中细胞可位于纤维内部，培养基通过扩散到达细胞，排出细胞代谢物。与动态生物反应器系统不同，中空纤维生物反应器可以提供与平面 T 型培养瓶等类似的培养模式。而且通过设计和优化，可以利用灌流方式将外泌体产物保留在培养室中，获得更浓缩的条件培养基，进而降低下游的液体处理负担。目前贴壁HEK293细胞和骨髓间充质干细胞 (BMSC)， 均已实现GMP 条件下在中空纤维生物反应器中生长，并分离出外泌体。
挑战及影响因素：
中空纤维生物反应器可以维持细胞生长，但在培养参数的放大和可控性方面仍具有很大挑战。外泌体的收获窗口具有时间限制，细胞在高密度下会发生接触抑制及相关的行为变化。有研究发现，以高密度 (90%) 接种的小鼠脂肪 MSC，在 48 小时内出现与细胞间接触抑制相关的各种基因的表达改变；而细胞过度融合之前收获外泌体，则能够更好地保持各项产品参数。
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搅拌式生物反应器 (SR)
摇瓶、Spinner、转瓶或生物反应器等都可作为动态培养细胞系统进行外泌体生产。动态培养可达到的细胞密度因不同的操作模式和培养类型而有所不同，SR主要用于中试和大规模生产，优点是易于放大、培养环境同质稳定、培养参数可控，可在线监测。依据细胞的特性，可进行全悬浮SR培养和微载体SR培养。
a. 悬浮适应细胞培养
SR生物反应器尤其适合悬浮适应细胞的外泌体生产。Margaret Liu等使用无动物来源化学成分明确细胞培养基，采用流加批次方式，成功在 0.5-5L SR 中建立了悬浮适应 HEK293 细胞外泌体生产的细胞培养工艺，同时研究了细胞培养工艺中的主要影响因素：
i. 抗结团剂，与其他悬浮适应的细胞系相比，HEK293细胞具有明显的结团倾向，通过使用抗结团剂纠正细胞的结团现象，可使细胞生长得到明显改善，VCD 从2.7 增至3.6 × 106 cells mL−1，单细胞外泌体产量从0.46 增至2.7 × 10e6 particles/cell，单位体积产量因此提高了8倍。
ii. 补料策略，与单纯补糖和GlutaMAX的批次培养相比，额外补充 3.5 g/ L的HyClone Cell Boost 补料可将VCD从 3.60增至6.31 × 10e6 cells mL−1，外泌体产量则由7.6 × 10e12 增加至54.7 × 10e12 /L。
iii. 收获时机，当收获时细胞活率从94%分别降至 76% 和48%时，包括外泌体在内的整体细胞外囊泡产量分别由37.0 × 10e12增加至 50.9 he56.5 × 10e12 particles/L，但同时也导致外泌体纯度和生物功能下降，因此该工艺采用了80-90%的较高收获时细胞活率。
b. 贴壁细胞的微载体悬浮培养
人间充质干细胞（hMSC ）是常用的外泌体产生细胞，具有贴壁依赖性。在SR中使用微载体悬浮培养，可明显增加hMSV等贴壁依赖细胞的培养效率及外泌体产量。与静态培养相比，生物反应器可提供更好的过程控制，但在控制反应器内环境参数的同时，保持细胞和衍生外泌体的表型不发生改变方面也存在很大挑战。当细胞从静态、平面培养转移到动态、需持续混合的 3D 环境时，搅拌和通气引起的剪切应力存在导致细胞水平及其分泌的外泌体表型改变的风险。有报道称，在转速为180 rpm生物反应器中培养T 细胞，会引起其白细胞介素 2 受体快速下调，细胞扩增减少。剪切应力可通过诱导MSCs的 p38 丝裂原活化蛋白激酶，和细胞外信号相关激酶的机械转导途径，导致其成骨分化，进而改变其外泌体表型。此外，限制高剪切动态系统中的细胞死亡以最大限度地减少来自凋亡囊泡的杂质至关重要。因为凋亡囊泡的与外泌体大小重叠，可能会增加异质性并降低外泌体产物的效力。
外泌体生产中的细胞培养基
一、含血清培养
基础培养基添加血清是贴壁依赖细胞培养最经典的培养方式，适合各种贴壁细胞的培养，可以最大限度保持细胞及其分泌的外泌体的天然表型。含血清培养用于外泌体生产最大的问题是血清本身含有外泌体，可以通过对血清进行外泌体去除处理减少污染。
二、无血清培养
除了血清自身的外泌体，从含血清培养基中分离出的外泌体会含有一些源自血清的杂质，可能会进入最终药物产品，从安全性和监管的角度来看是不利的。无血清培养可以很好的解决这些问题，但需要注意的是，无血清培养条件本身对适应含血清培养的细胞就是一种应激，有可能导致细胞的外泌体发生变化，及凋亡小体增加。有研究发现，相较含血清培养的神经母细胞瘤细胞系，在无血清培养基中培养产生的外泌体数量更多，大小或生化性质上没有差异。但蛋白质组学分析显示，无血清培养获得的外泌体含有更多的活性氧和应激相关蛋白。此外也有报道称源自含血清培养基的外泌体RNA 加工蛋白含量更高。因此无血清培养的前提是维持细胞特征和外泌体产品属性。需要对无血清应激下产生的外泌体的组成、治疗性能和安全性进行彻底研究，排除无血清培养应激引起的外泌体表型改变。