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肿瘤免疫在单抗、双抗、ADC药物、免疫检查点抑制剂等药物开发，以及CAR-T、TCR-T等基因治疗中的相关研究层出不穷。在研临床研究数量超过上千个，数量还在不断增加中。
下面我们就来看一下在药物开发以及免疫疗法的过程中，层析又会发挥什么样的关键作用？
黑色素瘤&免疫检查点抑制剂
在过去的十年中，免疫疗法极大地改变了肿瘤治疗的格局。目前，免疫检查点抑制剂（ICIs）已经成为免疫肿瘤学研究中最热门的领域之一。免疫检查点抑制剂就是针对特定的免疫检查点研发的一些药物，来阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞与免疫细胞之间的作用。目前展开研究的检查点通路靶点包括：CTLA-4、PD-1、LAG-3、KIR和OX40等。
2021年1月25日，FDA正式授予特瑞普利单抗(Toripalimab)快速通道资格，用于黏膜黑色素瘤的一线治疗。特瑞普利单抗是一款中国自主研发的针对T细胞表面PD-1的人源化IgG4的单抗，已经获批在中国市场销售，并在医保谈判中被纳入医保范围。
在中科院微生物所联合上海君实这项研究[1]里，首先重组表达带有6xHis标签的PD-1，收集上清液后在HisTrap HP镍离子亲和层析柱上粗纯，第二步用Superdex 200 10/300 GL分子筛层析柱进一步精纯得到了PD-1重组蛋白。随后将特瑞普利单抗酶解消化获得其Fab抗体片段，用HiTrap Protein A FF亲和填料做Fab片段的捕获，除去酶解过程中产生的杂质。
接下来把纯化后的重组PD-1蛋白和特瑞普利单抗Fab片段以1：1混合，冰上孵育30分钟并用Superdex 200 10/300 GL进一步纯化。得到的复合物蛋白晶体收集衍射数据，进行相互作用机制的分析后发现：特瑞普利单抗的HCDR3区域主要与PD-1的FG环结构结合，具有多种氢键相互作用，可以阻断 PD-1 与PD-L1，PD-L2之间的相互作用，作为免疫检查点抑制剂发挥抗肿瘤功能。
类似以上需要纯化蛋白样品来做结晶或冷冻电镜的实验，制备量通常较少，但纯度与回收率要求达到很高，更加适合使用微量纯化设备ÄKTA pure micro来完成层析步骤，减少稀释效应，提高分辨率。
图1. PD-1及特瑞普利单抗复合物的层析方法及机制解析结果
胃癌&双抗
疾病往往是复杂的，尤其是对于肿瘤疾病。而双抗往往有更精确的靶向性和更好的效果。胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，发病率在世界癌症发病率中位居第四位，死亡率居第二位，近二十年来亚洲地区胃癌发病率和死亡率呈现了逐年上升趋势。LewisY抗原是一种在大多数上皮癌（包括胃癌、卵巢癌等）中高度表达的聚糖，在多项临床试验中，LewisY已被评估认为是治疗上皮癌的有效靶点。
上海交通大学药学院联合杰科生物于2021年发表了一篇研究文章[2]，构建了以IgG-[L]-scfv格式的靶向LewisY和CD3双抗(m3s193)。构建好的双抗在哺乳动物细胞系HEK293F中表达良好。经过一步MabSelect SuRe亲和层析纯化后，双抗的产品纯度可达到95%以上，满足体外和体内测定。另外值得一提的是，MabSelect SuRe这款填料可以高效捕获抗体，且耐碱，可以反复使用。
随后的体外结果显示制备得到的这种双抗能激活CD8+T和CD4+T细胞，促进更多的T细胞浸润到肿瘤微环境中，显著抑制胃癌肿瘤的生长。同时表现出比亲本单抗更好的治疗效果，也为胃癌的治疗提供了更多基础研究。
图2. 靶向LewisY和CD3双抗(m3s193)的层析方法及活性验证
利用CRISPR/ Cas12a生成CAR-T细胞
肿瘤免疫相关的治疗药物除了以上两个案例提到的抗体或融合蛋白，嵌合抗原受体(CAR) T细胞疗法的出现也同样掀起了免疫治疗的热潮。目前临床多采用病毒的方式将CAR基因导入T细胞中，基于随机整合的原理使得基因整合至T细胞基因组中，这种方法一定程度上存在转录沉默、细胞癌变、异常增殖等风险。而利用基因编辑技术联合同源重组将CAR基因定点整合至T细胞特定基因座中则提供了一种更为安全的CAR-T细胞制备方法。
北京大学最近的一些相关研究[3-4]就正在尝试使用基因编辑技术，在精确的基因组位点中创建CAR-T细胞。将Cas12a蛋白在2YT培养基中表达，并用镍亲和柱与高分辨率的Superdex 200 Increase 10/300 GL分子筛层析柱两步纯化。随后将纯化的Cas12a蛋白利用基因密码子扩展技术共价偶连crRNA，形成Cas12a-crRNA共价复合物。用电转的方式将Cas12a-crRNA共价复合物导入原代T细胞中，对内源性TRAC基因进行了定点敲除，随后通过AAV将CAR基因导入T细胞中，促使CAR基因定点重组至TRAC基因座中，通过这种方法提供了一种高效制备定点整合CAR-T细胞的策略，且所制备的 CAR-T细胞具有良好的抗肿瘤效应，为Cas12a的广泛运用及临床研究奠定了基础。
图3. Cas12a蛋白的层析方法及基因编辑系统制备CAR-T细胞的研究思路
总结
在肿瘤相关药物开发以及免疫疗法的过程中，可见层析发挥了非常关键的作用。以上是层析在肿瘤免疫学中的一些应用案例分享。目前在该领域常用到的层析柱或填料包括分子筛的Superdex系列和Superose系列；标签蛋白亲和层析填料如His标签，Strep标签等亲和柱系列；抗体和抗体片段纯化常用的Mabselect PrismA系列。此外，精细纯化阶段阴、阳离子交换填料如Capto HiRes Q和Capto HiRes S系列等也经常使用。
Cytiva作为层析领域的先行者，可以提供从层析填料，到层析设备，以及层析方案等一系列产品与解决方案。