热门品牌
01
研究背景
作者研究中的片段双抗是一种串联的单链可变片段 (scFv) ，它包含了两个scFv区域的融合，并由一个短肽Linker连接。由于不含Fc区，因此不能用传统的单抗纯化的方法。接下来看看作者是怎么做的吧！
图1：片段双抗结构示意图
02
捕获：Protein L亲和层析
作者在捕获阶段采用Protein L亲和层析，其配基能够特异性的和抗体轻链相互作用结合。首先，将靶向CD19和CD3的片段双抗在CHO K1细胞成功表达后，离心取上清 (CCS) 。接下来，用含50 mM HEPES，120 mM NaCl，pH 7.4缓冲液平衡层析柱，将细胞上清以10 mg单体/mL填料的量进行上样。为了获得最佳的HCP去除效果和目的物的收率，使用ÄKTA avant内置的DoE功能对洗杂缓冲液中不同盐浓度和pH条件进行筛选，最终选取了513 mM Arg·HCl，87 mM NaCl，pH 6.7的缓冲液。此外，再用含有50 mM HEPES，pH 7.4缓冲液冲洗 5个CV ，以降低电导值。为了提高双抗单体与高分子量组分 (HMW) 的分离效果，作者在洗脱缓冲液中加入盐添加剂，通过两步洗脱：
第一步：洗脱中使用含100 mM Arg·HCl且pH 3.0乙酸缓冲液洗下主要为双抗单体组分（洗脱峰1，见下图a），并通过HPLC-SEC进行纯度鉴定（见下图b）；
第二步：洗脱中用不含盐添加剂的pH 3.0乙酸缓冲液洗下主要为HMW（洗脱峰2，见下图a）。
通过以上方法获得的洗脱液回收率为81.3%，HCP减少约3000倍，HMW从细胞培养上清液中的66.5%减少到7.1%。
图2：ÄKTA avant层析图谱，(a) Protein L亲和层析的两步洗脱；(b) 通过HPLC-SEC进行纯度鉴定
03
精纯：Capto adhere多模式层析
对于抗体药而言，仅一步亲和层析纯化是远不够的，使用多模式复合填料Capto Adhere能进一步去除内毒素、DNA、聚集体和HCP等。在继亲和层析对片段双抗特异性捕获之后，采用Capto adhere多模式层析的结合洗脱模式进行精纯。用50 mM MES、pH 6.0 缓冲液平衡层析柱，将上一步纯化得到的洗脱液调节至pH 6.0，稀释3倍至电导率6-7 mS/cm，然后上柱。在50 mM MES、300 mM、350 mM、400 mM NaCl，pH 6.0缓冲液中依次洗脱。最终在保障回收率的前提下，去除大量的残留聚集体，将片段双抗的单体纯度从92.3%提高到98.8%，满足工业生产需求。
图3：(a) 通过HPLC-SEC进行纯度鉴定；(b) SDS-PAGE的纯度鉴定
总 结
双抗独特的双靶点结合能力赋予了新的诊疗策略。而其表达情况和结构类型纷繁复杂，给下游纯化工艺带来了一定的挑战。通过ÄKTA avant内置的DoE方法可以大大提高实验条件筛选的效率，从而更加快速地找到最佳工艺条件。本文的两步纯化工艺（Protein L亲和层析+Capto adhere多模式层析），可将HMW和HCP分别降低至<1%和<100 ppm，总收率可达65%，纯度可达98.8%，证明了两步法纯化片段抗体的潜力。